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本制品是百奥莱博公司以探针法qPCR技术为基础开发的，专门用于普雷沃菌属(Prevotella spp.)研究检测的试剂盒。

普雷沃菌属是拟杆菌门中的一个菌属，它们是革兰氏阴性菌、非运动性、杆状、单细胞的细菌，可以在厌氧条件下生长。这个菌属包含50多个不同的物种，大多数可以从口腔和肠道中分离出来。普雷沃菌在人体中扮演着重要的角色，它们有助于分解蛋白质和碳水化合物食物。此外，普雷沃菌也被认为是条件致病菌，它们在一定条件下可以引起牙周和牙齿、肠道炎症、类风湿性关节炎、细菌性阴道炎等问题。普雷沃菌属的减少与某些疾病相关，例如自闭症。研究发现，被诊断患有自闭症的儿童的普雷沃菌属丰度较低，婴儿普雷沃菌水平的下降与两岁时的行为问题有关。普雷沃菌也与过敏有关，有食物过敏的儿童与没有食物过敏的儿童的肠道普雷沃菌属丰度存在差异。普雷沃菌广泛存在于人体的各个部位，包括皮肤、口腔、阴道和肠道等。普雷沃菌与人类健康和疾病的关系复杂，它们在不同身体部位的丰度和作用可能不同，且与饮食、生活方式和地理位置等宿主因素紧密相关，因此快速检测普雷沃菌属具有重要的意义。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据普雷沃菌属DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
   
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为5个数量级。
   
6. 本制品足够50次20μL体系的探针法qPCR反应。
   
7. 本制品只能用于科研。

普雷沃菌属通用qPCR引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后得到引物-探针混合液再使用，未用完的需要-20℃保存。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
   
3. 在6号管中加入5μL 10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL 10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得第4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
   
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。
   如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	PCR 阴性对照	标准曲线样品管 (1～6管)
    2×Probe qPCR MasterMix	各10μL	10μL	各10μL
    普雷沃菌属通用qPCR引物-探针混合液	各3μL	3μL	各3μL
    N+2个待测DNA样本	各7μL	不加	－
    超纯水	－	7μL	－
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	－	－	各7μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行qPCR：
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	5min
    PCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
    	58℃	15sec
    	72℃	30sec(采集FAM通道的荧光信号， 淬灭基团为TAMRA)

12. 如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
    
13. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
    
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须没有读数，或者大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。对待测样品，如果其Ct没有读数、大于或等于40则均为阴性，如果小于40则为阳性。